Pramoninės šarminės fosfatazės diagnostinio ELISA trikčių šalinimas

Pramoninės šarminės fosfatazės diagnostinės ELISA sistemos naudoja fermentą kaip reporterinį žymeklį, paprastai konjuguotą su antikūnu, antigenu, streptavidinu arba antriniu aptikimo reagentu. Skirtingai nuo birių techninių fermentų, diagnostinės klasės fermentų partijos turi būti atrenkamos dėl mažo trukdančių priemaišų kiekio, pastovaus aktyvumo, stabilaus konjugavimo elgesio ir atkuriamo substrato virsmo. ELISA metu šarminė fosfatazė dažniausiai derinama su chromogeniniu pNPP arba chemiliuminescenciniais dioxetane tipo substratais, o galutinį signalą lemia fermento apkrova, plovimo efektyvumas, inkubacijos laikas ir matricos poveikis. Trikčių šalinimą pradėkite nuo tyrimo formato, tikslinio mėginio tipo, reikiamo jautrumo ir plokštelės darbo eigos apibrėžimo. Ta pati fermento partija gali puikiai veikti viename imunotyrime, bet kitame rodyti didelį foną, jei blokatoriai, konservantai ar buferiai yra nesuderinami. Pirkėjai prieš bandomąjį darbą turėtų paprašyti techninių duomenų lapo, analizės sertifikato ir saugos duomenų lapo.

Geriausiai tinka: ELISA, diagnostikai ir imunotyrimo aptikimo reagentams • Pagrindinė rizika: aktyvumo arba fono partijų skirtumai • Pagrindiniai dokumentai: COA, TDS, SDS ir stabilumo duomenys

Šarminė fosfatazė yra aktyviausia šarminėmis substrato sąlygomis, dažnai apie pH 9.5 to 10.5 pNPP pagrįstam aptikimui, o konjugato laikymo buferiai paprastai yra arčiau neutralaus pH, pvz., pH 7.2 to 8.2, kad būtų apsaugota antikūno struktūra. Jei šarminės fosfatazės diagnostinis imunotyrimas rodo silpną signalą, prieš keisdami fermento tiekėją patikrinkite substrato buferio pH, galiojimo laiką, plokštelės plovimo pernešimą ir inhibitorių užterštumą. Fosfatas gali trukdyti kai kuriems fosfatazės darbo srautams, todėl buferio pasirinkimas turi būti patvirtintas pagal tiekėjo TDS. Magnio ir cinko jonai gali palaikyti daugelio šarminės fosfatazės preparatų aktyvumą, tačiau koncentracijos turi būti patvirtintos, nes per didelis druskų kiekis gali paveikti antikūno prisijungimą arba foną. Nereikėtų manyti, kad bendrinis laboratorinis receptas tiks pramoninei diagnostikai. Tvirtas ELISA metodas turėtų nurodyti buferio sudėtį, pH toleranciją, substrato inkubacijos laiką ir leistinas tuščio mėginio ribas.

Įprastas substrato pH intervalas: 9.5-10.5 • Įprastas konjugato laikymo pH: 7.2-8.2 • Patvirtinkite fosfato, chelatorių, konservantų ir druskų suderinamumą

Šarminės fosfatazės diagnostikos tiekėjas diagnostikai turėtų būti vertinamas pagal techninį tinkamumą, dokumentacijos kokybę, partijų nuoseklumą ir reagavimą metodo perkėlimo metu. Paprašykite COA, kuriame būtų nurodytas aktyvumo metodas, grynumas arba baltymo profilis, jei prieinama, išvaizda, laikymo sąlygos ir partijos numeris. TDS turėtų aprašyti rekomenduojamą tvarkymą, suderinamumą su buferiais ir su tyrimu susijusius apribojimus, o SDS padeda atlikti vidinę saugos peržiūrą. Nekvalifikuokite medžiagos remdamiesi vien katalogo aktyvumo vienetais; palyginkite funkcinį titrą savo ELISA, foną, stabilumą ir gedimų dažnį. Naudojimo sąnaudos gali būti palankesnės brangesniam diagnostinės klasės fermentui, jei jis leidžia didesnį skiedimą, mažiau pakartojimų, ilgesnį galiojimo laiką arba griežtesnį QC išleidimą. Prieš patvirtinimą atlikite bandomąjį validavimą su gamybai artimomis plokštelėmis, operatoriais, plovimo nustatymais ir mėginių matricomis. Nustatykite įeinančios QC kriterijus ir pakeitimų pranešimo lūkestį kritinės žaliavos kontrolei.

Kvalifikuokite su gamybai svarbiomis bandomosiomis partijomis • Lyginkite funkcinį titrą, o ne tik kainą už vienetą • Apibrėžkite įeinančios QC ir partijos keitimo peržiūros reikalavimus

Pirmiausia patvirtinkite plovimo efektyvumą, blokatoriaus suderinamumą, substrato inkubacijos laiką ir konjugato skiedimą. Per didelis fermento konjugato kiekis yra dažna priežastis, todėl atlikite skiedimo seriją ir palyginkite tuščio mėginio absorbanciją su teigiamo kontrolinio mėginio signalu. Taip pat patikrinkite substrato pH, užterštą plovimo buferį, plokštelės džiūvimą ir matricos trukdžius. Jei fonas išlieka didelis visomis sąlygomis, peržiūrėkite fermento COA ir palyginkite su kvalifikuota referencine partija.

Substrato etapas paprastai yra šarminis, dažnai apie pH 9.5 to 10.5 pNPP aptikimui, tačiau konjugatas gali būti laikomas arčiau pH 7.2 to 8.2, kad būtų apsaugotas antikūnas arba prisijungimo partneris. Nenaudokite vienos pH taisyklės visiems reagentams. Bandomojo validavimo metu patvirtinkite buferio suderinamumą, konservantų poveikį ir substrato instrukcijas tiekėjo TDS.

Lyginkite tiekėjus pagal funkcinį ELISA veikimą, o ne tik pagal nurodytus aktyvumo vienetus. Peržiūrėkite COA, TDS, SDS, partijos atsekamumą, laikymo gaires ir turimus stabilumo duomenis. Tada išbandykite kandidatus savo tyrime su gamybai artimomis plokštelėmis, plovimo nustatymais, mėginių matricomis ir operatoriais. Naudingi sprendimo taškai yra signalo ir fono santykis, CV, tiesiškumas, galiojimo laikotarpio elgsena, skiedimo faktorius, palaikymo reagavimas ir pakeitimų pranešimo praktika.

Katalogo aktyvumas dažnai matuojamas apibrėžtame biocheminiame tyrime, kuris gali neatspindėti jūsų konjuguoto imunotyrimo formato. Prastas ELISA veikimas gali atsirasti dėl konjugavimo santykio, trukdančių stabilizatorių, buferio neatitikimo, substrato sąlygų, antikūno pažeidimo, matricos poveikio arba padidėjusio nespecifinio prisijungimo. Atlikite palyginamuosius bandymus su referencine partija ir įvertinkite funkcinį titrą, foną ir stabilumą prieš atmesdami arba patvirtindami medžiagą.